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本试剂盒适用于从各种原代或传代培养动物细胞和各种动物实体组织样品中提取胞浆蛋白/核蛋白/组蛋白。本试剂盒含有的独特配方能够有效溶解细胞膜组分。本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物，阻止了蛋白酶对蛋白的降解，为提取高纯度的蛋白提供了保证。

本试剂盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白质电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然蛋白构象的活性蛋白，下游应用范围广，提取液裂解细胞的能力较温和，需要根据实际样本情况优化裂解时间。

本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。

本试剂盒提取的蛋白样本含有高浓度的盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用我公司其他货号的试剂盒。也可以将最后样品除盐后再用于2D电泳，用脱盐柱脱盐处理（相关产品HR0389）。

• 使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 提取过程简单方便。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 总蛋白提取液含多种有效成分，可充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
  
• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
  
• 下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。

• 细胞蛋白提取
  
  • 提取液准备：
    每200μL蛋白提取液A中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    每200μL蛋白提取液B中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    注：
    ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    ●蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶活性等下游实验时，注意根据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
    
  • 取5～10×10⁶个细胞，在4℃，1000×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
    注：
    ●细胞数量根据实验情况调整，每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
    ● 每个样至少需要一个6cm培养皿的细胞量（汇合度90～100%）。
    
  • 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
    注：在1000×g条件下离心5分钟。
    
  • 每5～10×10⁶细胞中加入400μL冷的提取液A，高速涡旋振荡15秒或吹打混匀，置2～8℃条件振荡15～30分钟。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 然后在4℃，5000×g条件下离心10分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
    
  • 沉淀用200μL PBS洗涤一次，在4℃，5000×g条件下离心5分钟，弃上清。
    
  • 在沉淀中加入100μL冷的提取液B，高速涡旋振荡5秒。
    注：根据后面和蛋白浓度测定的情况，可调整使用量，一般在50～200μL。
    
  • 置2～8℃条件振荡20分钟。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 在4℃，16000×g条件下离心15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。保留沉淀用于下步的组蛋白/染色质相关蛋白提取。
    
  • 在沉淀中加入100μL组蛋白提取液C，充分混匀。
    
  • 用200μL枪头反复吹打混匀或充分涡旋振荡混匀，置4℃冰箱过夜存放。
    
  • 在16000×g条件下离心10～15分钟，收集上清。
    
  • 在上清中加入10～20μL试剂D充分混匀，即得到组蛋白。
    
  • 在组蛋白样品中加入上样缓冲液混匀后煮沸，分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：加入上样缓冲液后应为上样缓冲液的蓝色，如果颜色变黄，可以再加入试剂D混匀，每次加入5μL，至恢复蓝色为止。
• 组织蛋白提取
  
  • 提取液制备：
    每200μL蛋白提取液A中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    每200μL蛋白提取液B中加入1μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
    注：
    ● 根据需要处理的样品数量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
    ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制剂。
    ● 蛋白样品用于测定某些细胞内蛋白酶活性等下游实验时，注意据实际情况调整抑制剂混合物是否加入。
    
  • 取适量组织样本，用手术剪刀尽可能剪碎，加冷PBS，用组织匀浆机/匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体，冰上静置5分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
    
  • 在4℃，500×g条件下离心5分钟，弃上清。
    
  • 每20～30μL细胞压积（沉淀体积）中加入200μL冷的提取液A，高速涡旋振荡15秒或吹打混匀，置2～8℃条件振荡20～30分钟。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 然后在4℃，5000×g条件下离心10分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
    
  • 沉淀用PBS洗涤一次，在4℃，5000×g条件下离心5分钟，弃上清。
    
  • 在沉淀中加入100～200μL冷的提取液B，高速涡旋振荡5秒。
    
  • 置2～8℃条件振荡30分钟。
    注：
    ● 用振荡器/摇床的较低转速，保持提取液轻微晃动即可。
    ● 没有振荡条件可以不振荡，稍微延长处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
    
  • 在4℃，16000×g条件下离心10～15分钟。
    
  • 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。留沉淀用于下步的组蛋白/染色质相关蛋白提取。
    
  • 在沉淀中加入100μL组蛋白提取液C，充分混匀。
    
  • 用200μL枪头反复吹打混匀或充分涡旋振荡混匀，置4℃冰箱过夜存放。
    
  • 在16000×g条件下离心10～15分钟，收集上清。
    
  • 在上清中加入10～20μL试剂D充分混匀，即得到组蛋白。
    
  • 在组蛋白样品中加入上样缓冲液混匀后煮沸，分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
    注：加入上样缓冲液后应为上样缓冲液的蓝色，如果颜色变黄，可以再加入试剂D混匀，每次加入5μL，至恢复蓝色为止。

• 细胞裂解速度慢？
  为了充分保证提取得到蛋白的活性，提取液采用独特的保护蛋白的配方，裂解能力温和，下游应用范围广。
  
• 蛋白浓度低？
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，胞质蛋白核蛋白均保持其天然构象和活性。